常规兔源多克隆抗体定制服务常规小鼠源多克隆抗体定制服务常规大鼠源多克隆抗体定制服务常规鸡源多克隆抗体制备服务快速抗体制备服务多克隆抗体制备服务小鼠源单克隆抗体定制服务大鼠源单克隆抗体定制服务仓鼠源单克隆抗体定制服务兔子单克隆抗体制备鸡单克隆抗体制备猴子单克隆抗体制备犬单克隆抗体制备单克隆抗体/杂交瘤细胞定制服务免疫组化保证性抗体制备转录后特殊修饰结构识别抗体制备抗专一亚型抗体制备配体模拟激活性抗体制备捕获\报告配对抗体制备功能阻遏\专一型抗抗体制备特殊功能抗体制备服务膜蛋白抗体制备服务半抗原抗体制备服务脂质体免疫抗体制备服务自体抗原抗体制备服务特殊性质抗原抗体制备服务基于全细胞抗原呈递的抗体制备方案基于传统单克隆抗体制备方案G蛋白偶联受体抗体制备服务抗离子通道蛋白抗体制备服务抗膜蛋白抗体制备专题噬菌体展示文库构建工程化骨架蛋白文库构建限制性多肽文库构建噬菌体展示文库筛选内化抗体筛选热稳定性scFv/Fab筛选蛋白酶底物筛选单域抗体库构建全人源单抗制备噬菌体展示和抗体文库服务双特异性纳米抗体制备单域(纳米)抗体库构建纳米抗体亲和力成熟服务人源/人源化纳米抗体制备DNA免疫技术制备膜蛋白纳米抗体抗血脑屏障纳米抗体制备纳米抗体服务细菌展示服务核糖体展示服务酵母展示服务体外展示&其他服务酵母双杂交筛选服务哺乳动物细胞双杂交服务胞内抗体制备服务双杂交服务原位杂交ISH荧光原位杂交FISH原位杂交服务X-射线晶体学通过肽库方法通过LC-MS法通过三维电镜方法基于生物信息学预测单克隆抗体表位作图抗体测序服务表面等离子共振服务(SPR)等温滴定量热法服务(ITC)双偏振极化干涉测量服务(DPI)差示扫描量热法服务(DSC)免疫原性评价抗体亲和力检测抗体鉴定抗体分析服务二价和双特异性scFv/Fab服务嵌合抗原受体(CAR)构建服务嵌合IgG构建scFV/Fab构建双可变区免疫球蛋白制备服务定制半胱氨酸改型抗体超长CDR3s牛抗体制备非猴抗体的硅烷化抗体稳定性改进抗体亲和力成熟抗体人源化服务抗体经典化服务人源抗体骆驼化服务人源抗体初始化服务抗体工程服务双特异性T细胞衔接器(BiTE)Fab-scFv融合蛋白KNODBS-INTO-HOLE技术杂交瘤细胞系双特异性抗体抗体和蛋白标记抗体生物素化Fab PEG化抗体偶联药物纳米金标记抗体糖纳米粒标记抗体标记服务酶和蛋白定向进化突变库构建服务蛋白工程服务抗体人源化亲和力成熟人源化牛超长CDR3抗体服务人源化纳米抗体制备人源化猴单抗制备人源/人源化抗体服务蛋白/抗体偶联服务生物素化服务寡聚糖生物偶联寡核苷酸生物偶联表面锚定服务脂质体偶联服务PEG修饰服务合成聚合物修饰生物偶联服务重组IgG制备scFv/Fab制备双特异性抗体制备抗体和蛋白纯化服务重组抗体制备服务稳定细胞系构建定制细胞裂解液稳定细胞系开发cGMP生产治疗性抗体和蛋白生产大规模发酵服务cGMP生产大肠杆菌蛋白表达系统枯草芽孢杆菌表达系统酵母蛋白表达系统昆虫杆状病毒表达系统哺乳动物细胞蛋白表达系统富含二硫键蛋白的原核表达服务无细胞系统蛋白表达服务Marzf单一蛋白制备服务蛋白表达与纯化服务抗体&多肽文库重组蛋白产品杂交瘤细胞系稳定细胞系CAR-T载体抗体定制服务平台噬菌体展示平台抗体药物开发平台CAR-T平台蛋白表达与纯化平台大规模发酵服务平台基因测序平台
原位杂交ISH

原位杂交ISH

In Situ Hybridization (ISH)

  

原理简介:

 原位杂交技术(in situhybridization)是以标记的核酸分子为探针,在组织细胞原位检测特异核酸分子的技术。使含有特异序列、经过标记的核酸单链即探针,在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交,再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测,从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。

可以检测cRNA、miRNA、LnRNA、DNA。可以各种种属的标本,包括哺乳动物、爬行动物、菌、植物标本。也可以检测组织芯片。

注:为了提高检测的成功率,请在取材前跟公司业务员联系,确认取材、固定、包埋要注意的事项。

样品保存:
RNA 保存:

RNase 酶的存在使 RNA 保存变得困难。此酶广泛存在于玻璃器皿上、试剂中以及操作人员身上及衣服上。RNase 可迅速破坏细胞中的 RNA 及 RNA 探针本身,因此用户的实验过程、手套和溶液需要保证无菌,防止探针或组织 RNA 受到 RNase 的污染。

冷冻切片的一般样品保存:
为了使保存的载片获得最佳结果,请勿将载片在室温环境下干燥保存。正确方法是,将其置于 100% 乙醇中-20 °C 保存,或将其用莎伦包装膜覆盖的塑料盒在 -20 °C 或 -80 °C条件下保存。这种保存方法可使载片保存数年。


探针选择:

RNA 探针:

RNA 探针长约 250–1500bp;长度为800bp左右的探针具有最佳灵敏度和特异性。转录模板应支持探针(反义链)和阴性对照(正义链)RNA 的转录。将转录模板克隆至包含对生启动子的载体可实现这一目的。制备探针之前,必须对环状模板进行线性化,但也可使用 PCR 模板。

DNA 探针:

DNA 探针为原位杂交提供较高的灵敏度。与RNA探针相比,DNA探针与靶mRNA 分子的杂交强度较弱,因此在杂交后的洗涤中不应使用甲醛。

探针特异性至关重要。如果已知细胞中mRNA或DNA的确切核苷酸序列,则可据此设计高度精确的互补探针。如果超过 5% 的碱基对不互补,那么探针只能与靶序列发生轻度杂交。这意味着,探针更容易在洗涤和检测步骤中被洗去,可能无法正确检测。


服务项目明细

价 格

服务项目明细

价 格

FISH

RNA水平

700元/张

CISH

RNA水平

700元/张

DNA水平

700元/张

DNA水平

700元/张

miRNA水平

700元/张

miRNA水平

700元/张

   

实验方案举例:
地高辛(DIG)标记RNA探针原位杂交实验方案

此方案介绍了如何使用DIG标记的RNA单链探针来检测石蜡包埋切片中目标基因的表达情况。

1) 脱蜡

如为冷冻切片请从第 2 步开始操作。

如为甲醛固定的石蜡包埋切片,请继续此步骤。

首先,对载片进行脱蜡和复水操作。如果石蜡去除不完全,则会导致切片的染色效果较差。

将载片置于支架上,然后执行以下洗涤操作:

二甲苯:2x3 分钟

1:1 的二甲苯和100%乙醇:3 分钟

100%乙醇:2x3 分钟

95%乙醇:3 分钟

70%乙醇:3 分钟

50%乙醇:3 分钟

使用冰冷的自来水清洗

抗原修复步骤之前将载片置于自来水中。从这一步开始,不能使载片干燥,因为干燥会导致非特异性抗体结合和高背景染色。

2) 抗原修复

将含20 µg/mL蛋白酶K的50mM Tris预热并在37 °C条件下孵育酶解10–20分钟。孵育时间和蛋白酶 K 的浓度可能需要根据实际情况优化。

我们建议通过蛋白酶 K 滴定实验来确定最佳条件。酶解不充分会导致杂交信号降低,过度酶解会影响组织形态,给杂交信号的定位带来极大困难。蛋白酶 K 的最佳浓度会随组织类型、固定时间和组织大小而发生变化。

3) 使用蒸馏水清洗载片5次。
4) 将载片浸入预冷的20% (v/v) 乙酸中20秒。这样可使细胞通透化,使探针或抗体能够透过。
5) 分别使用70%乙醇、95%乙醇和100%乙醇洗涤载片(每次约1分钟)使其脱水,然后风干。
6) 向每个载片中加入 100 µL 杂交液。

试剂

终浓度

每 1 mL 溶液的使用量

甲酰胺

50%

500 µL

5x

250 µL

丹哈德溶液

5x

50 µL

硫酸葡聚糖

10%

100 µL

肝素

20 U/µL

10 µL

十二烷基硫酸钠

0.1%

1 µL

盐溶液 (20x)

4 M NaCl

100 mM EDTA

200 mM Tris-HCl pH 7.5

100 mM NaH2PO4.2H2O

100 mM NaH2PO4.2H2O

丹哈德溶液 (100x)

10 g聚蔗糖

10 g PVP(聚乙烯吡咯烷酮)

10 g 牛血清白蛋白 (BSA)

500 ml无菌 dH2O

7) 将载片置于所需杂交温度下的增湿杂交盒中孵育1 小时。杂交温度的范围通常为 55–62 °C。
8) 在PCR 管中用杂交液稀释探针。利用PCR仪在95 °C条件下加热RNA 或DNA 2分钟,使其变性。然后立即将探针置于冰上冷却,以防止重退火。
9) 除去杂交液。向每个切片加入50–100μl探针稀释液,覆盖整个样品。在 65 °C 条件下在增湿的杂交盒中孵育过夜。用盖玻片盖住样品,以防样品蒸发。

在此步骤中,RNA 探针会与相应的mRNA杂交,或DNA探针会与相应的细胞DNA杂交。杂交温度的优化取决于所用的探针序列以及细胞或组织类型。所分析的每种组织类型都需进行杂交温度的优化。

探针的最佳杂交温度取决于靶序列中碱基的百分比含量。序列中胞嘧啶和鸟嘌呤的比例是关键因素。

10) 严格洗涤

通过调节温度、盐浓度和洗涤剂浓度等溶液参数可消除非特异性相互作用。

配制 1 L 20x 柠檬酸钠缓冲液 (SSC)

175.3 g 氯化钠 (3 M)

88.2 g 柠檬酸钠

800 mL 无菌水

使用柠檬酸将 pH 调节为5,定容至1 L 并使用高压灭菌器进行灭菌处理
洗涤 1

50% 甲酰胺的 2x SSC

3x5 分钟,37-45 ℃

在较高温度(高达 65° C)下短时间洗涤,洗去多余的探针和杂交缓冲液。如果洗涤时间过长,则会洗掉大量的杂交探针 RNA/DNA。

洗涤 2

   0.1–2x SSC

   3x5 分钟,25-75 ℃

此步骤会消除非特异性和/或重复性 DNA/RNA 杂交。

按照以下说明对严谨洗涤的温度和盐浓度进行优化:

· 对于极短的DNA/RNA 探针 (0.5–3 kb) 或极为复杂的探针,洗涤温度应更低(最高45 °C)且严格度更弱 (1–2xSSC)。

· 对于单基因座或较大的探针,温度应在65 °C 左右且严格度应较强(低于0.5x SSC)。

· 对于重复性探针,温度应达到最高且严格度应达到最强(例如 α-卫星重复序列)。

11) 在室温下使用 MABT(含 Tween20 的马来酸缓冲液)洗涤两次,每次30分钟。MABT 的性质比PBS 更温和,更适用于核酸检测。

配制 5x MABT 母液

   58 g 马来酸

   43.5 g NaCl

   55 g Tween-20

   900 mL 水

添加三羟甲基氨基甲烷,将 pH 调节至 7.5。大约需要 100 g 三羟甲基氨基甲烷。定容至 1 L。

12) 烘干载片。
13) 将其转移至增湿盒中,向每个切片加入 200 µL 封闭缓冲液(MABT + 2% BSA,牛奶或血清)。在室温下封闭 1–2 小时。
14) 去除封闭缓冲液。将抗标记抗体以所需稀释度加入封闭缓冲液。查看抗体说明书中推荐的浓度/稀释度。在室温下孵育 1–2 小时。
15) 在室温下使用 MABT 洗涤载片 5 次,每次 10 分钟。
16) 在室温下使用预染色缓冲液(100 mM Tris pH9.5,100 mM NaCl,10 mM MgCl2)洗涤载片 2 次,每次 10 分钟。
17) 如需进行荧光检测,请跳至第 18 步。对于其他形式的检测,请将载片放回增湿盒中,然后依照厂家说明书(如有说明书的话)使其显色。

18) 使用蒸馏水清洗载片。
19) 将载片风干 30 分钟。然后使用 100% 乙醇进行洗涤,并将其彻底风干。
20) 使用 DePeX 封片溶液进行封片。

原位杂交服务

相关服务:

★ 原位杂交ISH

★ 荧光原位杂交FISH

技术平台:

 抗体定制服务平台


在线咨询
 工作时间
周一至周五 :8:30-22:30
周六至周日 :9:00-18:00
 联系方式
客服热线:400-965-8633
固定电话:010-57263834
邮箱:inquiry@abiocenter.com

艾柏森(北京)生物科技有限公司

关于我们我们的服务我们的产品新闻动态

关于我们

抗体开发

噬菌体展示文库

合作伙伴

技术平台抗体工程多肽文库官方微信
新闻动态
GMP生产杂交瘤细胞株留言板
联系我们
蛋白表达与制备重组抗体友情链接


联系我们

地址:北京经济技术开发区同济中路7号兴盛国际

研发中心:无锡惠山经济开发区惠山大道1699号

     生命园C区C3栋3层

电话:010-57263834
邮箱:inquiry@abiocenter.com