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X-射线晶体学

X-射线晶体学

Epitope Mapping by X-ray Crystallography


技术介绍:

X-射线分辨单克隆抗体-抗原复合物是分析单克隆抗体识别表位的最可靠方法,该方法基于对单克隆抗体-抗原共晶体衍射的X-射线束的强度和角度测量,再用生物信息学的方法确定原子坐标,将复合体的三维结构完整可视化。

抗原表位分析对抗体人源化改造,抗体亲和力提高,抗体稳定性改造,发现新的功能表位,改变抗体特异性,设计新抗体,基于抗原-抗体相互作用的立体构型设计新型功能分子改造抗体都很重要。

应用该方法首先需获得纯度较高的抗原、抗体,并使其相互作用形成共晶,但由于成本及技术要求较高,难以建立结晶条件,某些细菌或病毒蛋白产量过低等原因,此方法并未广泛使用。

艾柏森同时有完备的蛋白质表达系统,如有需要请在网站内点击了解。

生物物理技术在表位作图中的应用:

X-射线衍射、冷冻电镜(cryo-EM)、核磁共振(NMR)、质谱(MS)和表面等离子体共振(SPR)等生物物理技术在利用单抗的B细胞表位作图研究中均发挥了重要作用。利用这些技术,不仅可以鉴定到构象性B 细胞表位,也可以鉴定线性B细胞表位。抗原-单抗复合物的 X-射线晶体学分析是目前最准确的B细胞表位鉴定方法。

它可以精确地确定抗原分子中与单抗发生相互作用的氨基酸残基,甚至可以定位抗原上被单抗识别并结合的氨基酸残基的主链或侧链原子。不论被单抗识别的是构象性B细胞表位,还是线性B细胞表位,都可以通过抗原-单抗复合物的X-射线晶体学分析得到解析。

由于抗原-单抗复合物的 X-射线晶体学分析涉及抗原和单抗的纯化、抗原-单抗复合物的形成与纯化以及复合物的晶体学解析等,需要专业技术和大量资金支持;这对于一些可溶性的简单抗原来说就常常是一项难以完成的任务,而对于许多复杂抗原(如膜蛋白)而言则更加困难。因此,虽然目前已经鉴定到成千上万的单克隆抗体,但只有少数 B 细胞表位通过抗原-抗体复合物的X-射线晶体学分析方法得到解析。

由于需要对样品进行衍生和干燥,电子显微镜不适于研究抗原-单抗间的相互作用。但自2013 年冷冻电镜技术的建立使电镜技术研究抗原-单抗复合物的结构成为可能。由于冷冻电镜技术仅需要少量抗原-单抗复合物,不需要高纯度蛋白,也不用对复合物进行结晶,可以用于分析其它方法(如X-射线晶体学技术)无法解析的大分子复合物的结构,因此,冷冻电镜技术在表位作图方面比 X-射线晶体学技术更具优势。

目前,冷冻电镜技术常与X-射线晶体学技术相结合应用于B细胞表位作图研究。单独或与X-射线晶体学技术相结合,冷冻电镜技术已经用于 HIV、HPV 等病毒结构蛋白的B细胞表位作图研究。第三种应用于利用单抗的B细胞表位作图研究的生物物理技术是核磁共振技术。

核磁共振技术的分辨率恰好适合在原子水平解析抗原-抗体复合物中相互作用界面的结构信息,即 B细胞表位鉴定。该方法通过分析抗原本身与抗原-单抗复合物核磁共振信号的差异,可以快速、准确地确定抗原的B细胞表位氨基酸基序。基于核磁共振技术的B 细胞表位作图可以提供比突变体肽库或肽库筛选技术更详细的表位信息,同时又比X-射线晶体学技术更加快速。但是,利用核磁共振技术解析抗原的B细胞表位需要首先确定抗原中每个氨基酸残基的核磁共振信号,这对于大分子抗原来说是一个很大的挑战。

核磁共振技术单独或者与其他方法相结合已成功用于多种病原微生物结构蛋白的 B细胞表位作图研究。质谱也以其快速的优点而广泛用于B细胞表位的鉴定。在该方法中,首先在抗体存在或不存在条件下,以蛋白酶酶解抗原蛋白,然后利用质谱分析经分离纯化的酶切产物,从而确定被抗体保护的抗原蛋白的边界(表位区域) 。

这种B细胞表位作图方法的不足之处在于其只能鉴定到30−60个氨基酸残基的表位片段,不能进行表位的精确定位。虽然氕/氘交换-质谱技术提高了其表位作图的精确度,但仍低于基于X-射线晶体学技术和冷冻电镜技术的表位作图方法的精确度。经过 25 年的发展,随着样品处理技术的提高和先进质谱仪的问世,基于质谱技术的 B 细胞表位作图所需的样品量更低,可以在不降低准确性的前提下分析更加复杂的抗原样品。

基于质谱技术的 B 细胞表位作图方法不再仅限于利用单克隆抗体的表位鉴定,已经扩展到利用多克隆抗体的 B 细胞表位作图。表面等离子共振技术近年来迅速发展并应用到生物分子相互作用的研究领域。该技术不仅具有无需标记、特异性强、灵敏度高、样品用量小的优点,而且可实现在线连续实时检测。

基于表面等离子共振技术的 B 细胞表位作图类似于ELISA技术,虽然其B细胞表位作图的分辨率低于基于 X-射线晶体学技术和冷冻电镜技术的表位作图方法的分辨率,但其可以快速、高通量地进行系列抗原突变体或片段与单抗的结合能力的分析。表面等离子共振技术单独或与噬菌体展示技术等其它B细胞表位作图技术结合已经用于多种抗原分子的 B 细胞表位作图研究。

综上所述,基于生物物理技术的利用单抗的B细胞表位作图虽然都可以进行B细胞表位鉴定,但这些方法都需要昂贵的仪器,有的还需要抗原-抗体复合物的晶体结构信息或者需要专业技术人员的辅助才能完成。因此,X-射线晶体学技术、冷冻电镜技术和核磁共振技术更多地用于重要病原的中和性单抗识别的B细胞表位鉴定,它们都是B细胞表位作图方法的重要组成部分。


X-射线晶体学;Epitope Mapping by X-ray Crystallography



公司优势:

目前有几种方法用于抗原表位的分析:X-射线晶体学、噬菌体呈递展示随机肽库、LC-MS分析、3D-EM分析等;其中X-射线晶体衍射的方法是最精确的方法,通过抗原-抗体共结晶的方法可以精确到原子级别。

艾柏森生物可以提供IgG、Fab、scFv、F(ab,)2、nanobody、串联scFV等抗体形式的表位作图。

如果您苦于无法得到优质蛋白,艾柏森同时有相关蛋白质表达业务,随时为您提供全面优质的服务。

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