原理简介: 原位杂交技术(in situhybridization)是以标记的核酸分子为探针,在组织细胞原位检测特异核酸分子的技术。使含有特异序列、经过标记的核酸单链即探针,在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交,再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测,从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。 可以检测cRNA、miRNA、LnRNA、DNA。可以各种种属的标本,包括哺乳动物、爬行动物、菌、植物标本。也可以检测组织芯片。 注:为了提高检测的成功率,请在取材前跟公司业务员联系,确认取材、固定、包埋要注意的事项。 样品保存: 冷冻切片的一般样品保存: 探针选择: RNA 探针: RNA 探针长约 250–1500bp;长度为800bp左右的探针具有最佳灵敏度和特异性。转录模板应支持探针(反义链)和阴性对照(正义链)RNA 的转录。将转录模板克隆至包含对生启动子的载体可实现这一目的。制备探针之前,必须对环状模板进行线性化,但也可使用 PCR 模板。 DNA 探针: DNA 探针为原位杂交提供较高的灵敏度。与RNA探针相比,DNA探针与靶mRNA 分子的杂交强度较弱,因此在杂交后的洗涤中不应使用甲醛。 探针特异性至关重要。如果已知细胞中mRNA或DNA的确切核苷酸序列,则可据此设计高度精确的互补探针。如果超过 5% 的碱基对不互补,那么探针只能与靶序列发生轻度杂交。这意味着,探针更容易在洗涤和检测步骤中被洗去,可能无法正确检测。
实验方案举例: 此方案介绍了如何使用DIG标记的RNA单链探针来检测石蜡包埋切片中目标基因的表达情况。 1) 脱蜡 如为冷冻切片请从第 2 步开始操作。 如为甲醛固定的石蜡包埋切片,请继续此步骤。 首先,对载片进行脱蜡和复水操作。如果石蜡去除不完全,则会导致切片的染色效果较差。 将载片置于支架上,然后执行以下洗涤操作: 二甲苯:2x3 分钟 1:1 的二甲苯和100%乙醇:3 分钟 100%乙醇:2x3 分钟 95%乙醇:3 分钟 70%乙醇:3 分钟 50%乙醇:3 分钟 使用冰冷的自来水清洗 抗原修复步骤之前将载片置于自来水中。从这一步开始,不能使载片干燥,因为干燥会导致非特异性抗体结合和高背景染色。 2) 抗原修复 将含20 µg/mL蛋白酶K的50mM Tris预热并在37 °C条件下孵育酶解10–20分钟。孵育时间和蛋白酶 K 的浓度可能需要根据实际情况优化。 我们建议通过蛋白酶 K 滴定实验来确定最佳条件。酶解不充分会导致杂交信号降低,过度酶解会影响组织形态,给杂交信号的定位带来极大困难。蛋白酶 K 的最佳浓度会随组织类型、固定时间和组织大小而发生变化。 3) 使用蒸馏水清洗载片5次。
盐溶液 (20x) 4 M NaCl 100 mM EDTA 200 mM Tris-HCl pH 7.5 100 mM NaH2PO4.2H2O 100 mM NaH2PO4.2H2O 丹哈德溶液 (100x) 10 g聚蔗糖 10 g PVP(聚乙烯吡咯烷酮) 10 g 牛血清白蛋白 (BSA) 500 ml无菌 dH2O 7) 将载片置于所需杂交温度下的增湿杂交盒中孵育1 小时。杂交温度的范围通常为 55–62 °C。 在此步骤中,RNA 探针会与相应的mRNA杂交,或DNA探针会与相应的细胞DNA杂交。杂交温度的优化取决于所用的探针序列以及细胞或组织类型。所分析的每种组织类型都需进行杂交温度的优化。 探针的最佳杂交温度取决于靶序列中碱基的百分比含量。序列中胞嘧啶和鸟嘌呤的比例是关键因素。 10) 严格洗涤 通过调节温度、盐浓度和洗涤剂浓度等溶液参数可消除非特异性相互作用。 配制 1 L 20x 柠檬酸钠缓冲液 (SSC) 175.3 g 氯化钠 (3 M) 88.2 g 柠檬酸钠 800 mL 无菌水 使用柠檬酸将 pH 调节为5,定容至1 L 并使用高压灭菌器进行灭菌处理 50% 甲酰胺的 2x SSC 3x5 分钟,37-45 ℃ 在较高温度(高达 65° C)下短时间洗涤,洗去多余的探针和杂交缓冲液。如果洗涤时间过长,则会洗掉大量的杂交探针 RNA/DNA。 洗涤 2 0.1–2x SSC 3x5 分钟,25-75 ℃ 此步骤会消除非特异性和/或重复性 DNA/RNA 杂交。 按照以下说明对严谨洗涤的温度和盐浓度进行优化: · 对于极短的DNA/RNA 探针 (0.5–3 kb) 或极为复杂的探针,洗涤温度应更低(最高45 °C)且严格度更弱 (1–2xSSC)。 · 对于单基因座或较大的探针,温度应在65 °C 左右且严格度应较强(低于0.5x SSC)。 · 对于重复性探针,温度应达到最高且严格度应达到最强(例如 α-卫星重复序列)。 11) 在室温下使用 MABT(含 Tween20 的马来酸缓冲液)洗涤两次,每次30分钟。MABT 的性质比PBS 更温和,更适用于核酸检测。 配制 5x MABT 母液 58 g 马来酸 43.5 g NaCl 55 g Tween-20 900 mL 水 添加三羟甲基氨基甲烷,将 pH 调节至 7.5。大约需要 100 g 三羟甲基氨基甲烷。定容至 1 L。 12) 烘干载片。 18) 使用蒸馏水清洗载片。 相关服务: ★ 原位杂交ISH ★ 荧光原位杂交FISH 技术平台: ★ 抗体定制服务平台 |
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