常规兔源多克隆抗体定制服务常规小鼠源多克隆抗体定制服务常规大鼠源多克隆抗体定制服务常规鸡源多克隆抗体制备服务快速抗体制备服务多克隆抗体制备服务小鼠源单克隆抗体定制服务大鼠源单克隆抗体定制服务仓鼠源单克隆抗体定制服务兔子单克隆抗体制备鸡单克隆抗体制备猴子单克隆抗体制备犬单克隆抗体制备单克隆抗体/杂交瘤细胞定制服务免疫组化保证性抗体制备转录后特殊修饰结构识别抗体制备抗专一亚型抗体制备配体模拟激活性抗体制备捕获\报告配对抗体制备功能阻遏\专一型抗抗体制备特殊功能抗体制备服务膜蛋白抗体制备服务半抗原抗体制备服务脂质体免疫抗体制备服务自体抗原抗体制备服务特殊性质抗原抗体制备服务基于全细胞抗原呈递的抗体制备方案基于传统单克隆抗体制备方案G蛋白偶联受体抗体制备服务抗离子通道蛋白抗体制备服务抗膜蛋白抗体制备专题噬菌体展示文库构建工程化骨架蛋白文库构建限制性多肽文库构建噬菌体展示文库筛选内化抗体筛选热稳定性scFv/Fab筛选蛋白酶底物筛选单域抗体库构建全人源单抗制备噬菌体展示和抗体文库服务双特异性纳米抗体制备单域(纳米)抗体库构建纳米抗体亲和力成熟服务人源/人源化纳米抗体制备DNA免疫技术制备膜蛋白纳米抗体抗血脑屏障纳米抗体制备纳米抗体服务细菌展示服务核糖体展示服务酵母展示服务体外展示&其他服务酵母双杂交筛选服务哺乳动物细胞双杂交服务胞内抗体制备服务双杂交服务原位杂交ISH荧光原位杂交FISH原位杂交服务X-射线晶体学通过肽库方法通过LC-MS法通过三维电镜方法基于生物信息学预测单克隆抗体表位作图抗体测序服务表面等离子共振服务(SPR)等温滴定量热法服务(ITC)双偏振极化干涉测量服务(DPI)差示扫描量热法服务(DSC)免疫原性评价抗体亲和力检测抗体鉴定抗体分析服务二价和双特异性scFv/Fab服务嵌合抗原受体(CAR)构建服务嵌合IgG构建scFV/Fab构建双可变区免疫球蛋白制备服务定制半胱氨酸改型抗体超长CDR3s牛抗体制备非猴抗体的硅烷化抗体稳定性改进抗体亲和力成熟抗体人源化服务抗体经典化服务人源抗体骆驼化服务人源抗体初始化服务抗体工程服务双特异性T细胞衔接器(BiTE)Fab-scFv融合蛋白KNODBS-INTO-HOLE技术杂交瘤细胞系双特异性抗体抗体和蛋白标记抗体生物素化Fab PEG化抗体偶联药物纳米金标记抗体糖纳米粒标记抗体标记服务酶和蛋白定向进化突变库构建服务蛋白工程服务抗体人源化亲和力成熟人源化牛超长CDR3抗体服务人源化纳米抗体制备人源化猴单抗制备人源/人源化抗体服务蛋白/抗体偶联服务生物素化服务寡聚糖生物偶联寡核苷酸生物偶联表面锚定服务脂质体偶联服务PEG修饰服务合成聚合物修饰生物偶联服务重组IgG制备scFv/Fab制备双特异性抗体制备抗体和蛋白纯化服务重组抗体制备服务稳定细胞系构建定制细胞裂解液稳定细胞系开发cGMP生产治疗性抗体和蛋白生产大规模发酵服务cGMP生产大肠杆菌蛋白表达系统枯草芽孢杆菌表达系统酵母蛋白表达系统昆虫杆状病毒表达系统哺乳动物细胞蛋白表达系统富含二硫键蛋白的原核表达服务无细胞系统蛋白表达服务Marzf单一蛋白制备服务蛋白表达与纯化服务抗体&多肽文库重组蛋白产品杂交瘤细胞系稳定细胞系CAR-T载体抗体定制服务平台噬菌体展示平台抗体药物开发平台CAR-T平台蛋白表达与纯化平台大规模发酵服务平台基因测序平台

RNA干扰整体实验服务—RNAi基因干扰

RNA干扰整体实验服务—RNAi基因干扰

RNA干扰(RNAi基因干扰、SiRNA实验):RNA干扰(RNA interfering,RNAi)现象是指由与靶基因序列同源的双链RNA(DsRNA)引发的基因转录后的沉默过程,小干扰RNA特异性介导相同序列的mRNA降解,阻断相应基因表达。艾柏森生物提供的RAN干扰技术包括化学合成小RNA片段(SiRNA)和构建载体RNA(SnRNA)两种形式。实验委托者只需提供干预基因名称或基因序列ID,艾柏森生物免费设计合适的干预位点,保证至少有一对小RNA有效抑制目的基因表达,抑制效率不低于70%。


RNA干扰(SiRNA实验)流程
第一步 确定干扰基因,设计并合成合适的小干扰RNA(片段型或载体型小干扰RNA)。
第二步  预转染实验,进行细胞培养,摸索转染条件、时间并进行必要的检测(WB、PCR等),确定干预效果最佳的一对小RNA。
第三步  正式实验,设置合理实验分组,进行瞬时或稳定转染。
第四步  转染后检测,根据实验要求选择细胞生物学检测、蛋白检测、分子生物学检测等。以研究小干扰RNA对于细胞、蛋白或基因功能的影响。


RNA干扰(SiRNA实验)检测(可根据委托者实验需求选择做)
1. 细胞检测:细胞增殖毒性MTT、细胞凋亡、细胞周期、细胞迁移、细胞侵袭;
2. 蛋白检测:免疫印迹WB、免疫细胞化学ICC、免疫荧光IF、流式细胞术FCM、酶联免疫ELSIA;
3. 分子生物检测:RT-PCR、实时荧光定量PCR、甲基化特异性PCR(MSP);
4. 其他检测:生化检测、酶类检测、脂类检测、糖类检测。


实验咨询:service@abiocenter.com


实验案例: YYYY细胞在XXXX基因干扰后的增殖及侵袭能力实验
第一部分:实验细胞筛选
一、免疫荧光实验

实验试剂:PBS(磷酸盐缓冲液pH7.4),非免疫山羊血清,Triton X-100,BSA抗体稀释液,XXXX蛋白一抗 (1:100),二抗AlexaFluor 555 goat anti-rabbit IgG (H+L) *2 mg/mL*(A21428)
免疫荧光(IF)染色:倒出细胞培养液,PBS冲洗三次;2-4%甲醛固定15分钟;1×PBS缓冲液(0.01 M,pH7.4)洗涤3次,每次5分钟;滴加非免疫山羊血清(内含0.3%Triton X-100)封闭液,覆盖液面2-3mm,室温放置60min,甩去多余液体;滴加一抗plscr1 50μL(1:100),4℃过夜;PBS洗3次,每次5分钟;滴加荧光标记的上述二抗50μL(1:200),室温 60分钟;PBS洗3次各5min;荧光显微镜下观察、拍照,每指标照相2套图像。
IF染色结果(400倍): 通过荧光染色可以分析出,XXXX蛋白在YYYY细胞中表达量最突出。
YYYY细胞


RNAi基因干扰


AAAA细胞  

RNAi基因干扰


BBBB细胞


RNAi基因干扰    

CCCC细胞


RNAi基因干扰

二、RT-PCR实验
实验材料:细胞样品4份,分组编号(见图片标示)
试剂:TrizolReagent,Invitrogen  Cat.NO.15596-026;ReverTraAce-α-TM  First Strand cDNA Synthesis Kit ,TOYOBO#FSK-100;PCR Master Mix(2x) Fermentas # K0172;DNA Marker DL2,000, TaKaRa D501A;0.1%DEPC水、氯仿(分析纯)、异丙醇(分析纯)75%乙醇;AGAROSE(琼脂糖)  AMRESCO,K499;10×DNA上样缓冲液, 美国ProMab,SJ-R2008523;0.5mg/ml EB 溶液,实验室常备;1×TBE, 实验室常备,配方参照《分子克隆实验指南 第二版》
仪器:PCR仪,ABI9600;电泳仪,北京六一仪器公司,DYCP-31DN型;高速离心机,湘仪H1650-W; 紫外分光光度计,上海江仪仪器有限公司,UV-7502C(751);成像系统,柯达紫外显相系统 400W像素
引物资料:
Homo- XXXX-F    5-cacccatgtctaccaaagtt -3,Homo-XXXX-R    5- ctctcaaaattccagtccag -3,片段长度: 175bp
Homo-GAPDH-F  5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3,Homo-GAPDH-R  5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3,片段长度   450bp
实验步骤:
1、RNA提取:每样本加入1mlTrizol试剂消化(组织约50mg—100mg充分剪碎,细胞约106—107);匀浆样品在室温静置5~10min后加入0.2倍体积的氯仿,震荡15秒后在2~8℃下12,000×g离心15min;将水样层转移至干净的试管,加入0.5倍体积的异丙醇,混匀后-20℃下静置10-15min,在2~8℃下12,000×g离心10min;移去上层悬液,将RNA沉淀用1ml 75%乙醇洗涤,在震荡器上混匀后2~8℃下7,500×g离心5min,弃去上清液;适度干燥RNA沉淀后,加入适量0.1% DEPC水,使RNA完全溶解;2000rpm离心20sec
2、总 RNA 定量:紫外分光光度计开机预热30 min;用蒸馏水洗涤石英比色皿,吸水纸吸干,加入DEPC水后,放入样品室的S池架上,关上盖板;设定紫外光波长(260nm、280nm)后校零(每次检测前均需调零);将待测样品适当稀释(RNA 1μl用DEPC水稀释至250μl)后,记录编号和稀释度;把装有稀释后待测样品的比色皿放进样品室的S架上,关闭盖板;分别测定260nm和280nm波长时的OD值(吸光度在0.1—0.5范围为最佳);用蒸馏水洗涤石英比色皿,酒精浸泡。
3、实验结果判断:纯DNA:OD260/OD280≈1.8(>1.9,表明有RNA污染;<1.6,表明有蛋白质、酚等污染) 纯RNA:OD260/OD280≈2.0(<1.7时表明有蛋白质或酚污染;>2.0时表明可能有异硫氰酸残存)

样本编号

稀释倍数

A260

A280

A260/A280

RNA浓度(ug/ul)

YYYY

250

0.348

0.179

1.944

3.48

AAAA

250

0.289

0.151

1.914

2.89

BBBB

250

0.302

0.159

1.899

3.02

CCCC

250

0.333

0.171

1.947

3.33


计算A260/ A280比值,比值≥1.8,满足实验要求。        
RT-PCR实验步骤:
产物用琼脂糖凝胶电泳检测:扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳,加样量为10μl(DNA样本8μl+上样缓冲液2μl) ,电压120V ,电泳完毕后在溴化乙锭( EB)中染色约15分钟,清水漂洗后凝胶成像系统拍照。
凝胶图片与平均光密度值:阳性条带以Gelpro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析,测其IOD值。


RNAi基因干扰


点样说明及IOD参考值分析:

泳道

1

2

3

4

样品

YYYY

AAAA

BBBB

CCCC

XXXX基因

15930

8099

10591

12963

R

0.603

0.325

0.438

0.545

泳道

5

6

7

8

样品

YYYY

AAAA

BBBB

CCCC

GAPDH

26431

24934

24206

23786


R值为目的基因PLSCR1参考IOD值/内参基因GAPDH参考IOD值
XXXX基因在YYYY细胞中表达量最突出。


三、WB实验
实验试剂:XXXX蛋白多抗(1:400),37Ka;GAPDH单抗(1:1000),37Ka;RabbitAnti Goat IgG/HRP(1:30,000);GoatAnti mouse IgG/HRP(1:50,000)
WB操作流程:
实验结果:阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析,测其IOD(integrated optical density)累积光密度参考值。


Lanes:

Lane  1

Lane  2

Lane  3

Lane  4

Rows

(IOD)

(IOD)

(IOD)

(IOD)

XXXX

131.69

51.667

65.03

97.148

GAPDH

283.05

282.52

290.29

289.44

样本

YYYY

AAAA

BBBB

CCCC


XXXX蛋白在YYYY细胞中表达量最高。
通过上述实验,确定有YYYY细胞来进行XXXX基因沉默实验最具意义。


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